Sekwencjonowanie

Sekwencjonowanie Sangera

Wcześniej metody chemii analitycznej były w stanie określić skład kwasów nukleinowych. Jednak Fred Sanger i współpracownicy opracowali metody - początkowo wykorzystujące trawione fragmenty znakowane radioaktywnie i dwuwymiarowe frakcjonowanie - aby zapewnić jedne z pierwszych kompletnych sekwencji nukleinowych. Postępy w tej dziedzinie trwały przez kilka dziesięcioleci, a każde ulepszenie dodawało do rosnącej biblioteki sekwencjonowanych białek i genomów. Ulepszenia te obejmują rozdzielanie nukleotydów według długości za pomocą elektroforezy żelowej, a następnie elektroforezy kapilarnej. Dodatkowo, włączenie fluorescencyjnie znakowanych nukleotydów i zautomatyzowana analiza komputerowa każdego fragmentu kwasu nukleinowego definiują obecnie nowoczesną metodę sekwencjonowania Sangera.

Metodologia sekwencjonowania DNA

Podczas gdy metody sekwencjonowania DNA były stale ulepszane od czasu powstania tej technologii, kilka podstawowych elementów jest nadal niezbędnych i wykorzystywanych przez nowoczesne platformy sekwencjonowania DNA. Przygotowanie DNA zazwyczaj obejmuje izolację i oczyszczanie DNA z organizmu gospodarza. Dodatkowe krytyczne składniki, w tym wolne zasady DNA, startery DNA, zmodyfikowane zasady DNA zawierające znaczniki fluorescencyjne (zasady terminatora) i polimerazę DNA dodaje się razem do jednego naczynia. Naczynie zawierające wszystkie te składniki poprzez serię etapów ogrzewania i chłodzenia wytworzy bibliotekę małych sekwencji DNA w stosunku do sekwencji DNA o pełnej długości, z których każda kończy się fluorescencyjnie znakowaną końcową zasadą terminatora. Nowe nici DNA zawierające fluorescencyjnie znakowane końcowe nukleotydy są rozdzielane według długości, przepuszczane przez rurkę kapilarną i układane według rozmiaru. Laser jest następnie używany do wzbudzenia fluorescencyjnej zasady na każdej nici, podczas gdy kamera rejestruje sygnał. Wreszcie, komputer jest zwykle używany do składania zebranych informacji w sekwencję DNA o pełnej długości.