Znakowanie i wykrywanie kwasów nukleinowych

Znakowanie kwasów nukleinowych i sondy

Kwasy nukleinowe mogą być znakowane w całej cząsteczce lub na końcach 5' i 3'. Sondy kwasów nukleinowych są szczególnie przydatne w testach hybrydyzacji, takich jak wykrywanie RNA w northern blot lub DNA w Southern blot. W celu rozprowadzenia etykiety w sondzie stosuje się różne metody znakowania, w tym PCR ze znakowanymi dezoksynukleotydami (dNTP) lub trifosforanami nukleotydów (NTP), losowe gruntowanie i translację nicków. Znakowanie końcowe jest szczególnie przydatne w testach badających interakcje kwasów nukleinowych z białkami w celu uniknięcia przeszkód sterycznych.

Testy znakowania i wykrywania kwasów nukleinowych

W zależności od metody znakowania, wykrywanie kolorymetryczne jest często stosowane w przypadku sond znakowanych enzymami, podczas gdy wykrywanie autoradiograficzne jest odpowiednie dla sond radioaktywnych. Typowe sondy obejmują digoksygeninę (DIG) i sondy znakowane fluoresceiną i mogą być stosowane w połączeniu w celu ułatwienia wykrywania sond wielokolorowych w połączeniu z reakcjami kolorymetrycznymi (np. fosfatazą alkaliczną). Podobnie, włączenie biotyny-16-dUTP za pomocą PCR jest również możliwe w przypadku większości polimeraz DNA jako dodatkowa metoda znakowania i wykrywania. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) wykorzystuje sondy fluorescencyjne do wykrywania sekwencji DNA, a pomyślne wykrycie i dalsza analiza są częściowo zdeterminowane przez czułość i rozdzielczość mikroskopu fluorescencyjnego dostępnego dla badacza.

Znakowane zastosowania DNA i RNA

Transfer makrocząsteczek na membrany w fazie stałej jest znany jako blotting. Ze względu na specyficzność znakowanych sond, hybrydyzacja kwasu nukleinowego i sondy zapewnia badaczom możliwość wykrywania zarówno sekwencji DNA, jak i RNA w złożonych mieszaninach kwasów nukleinowych. Ponadto metody te pozwalają na gromadzenie dodatkowych cennych informacji, w tym analizę ekspresji genów, wielkości mRNA i liczby kopii w zależności od testu. Hybrydyzacja in situ jest również powszechnie stosowana przez naukowców do wykrywania jednej lub więcej różnie znakowanych sond (np. DIG i sond znakowanych fluoresceiną).