ペルオキシダーゼ（EC 1.11.1.7）のイムノアッセイ：基質としての2,2'-アジノ-ビス（3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸）

文書履歴

SPABTS02を更新。現行のQUMASフォーマッティングガイドラインに準拠するために改訂された手順。CR SOP-DEK-ENZ42をご参照ください。

1．目的

2,2'-アジノ-ビス（3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸）を基質として用いるペルオキシダーゼのアッセイ手順の標準化

2．適用範囲

この手順は、基質として2,2'-アジノ-ビス（3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸）を用いるペルオキシダーゼの活性に関する規格を有するすべての製品に適用されます。

3．定義

3.1．    精製水 － 脱イオンシステム（25℃で、18 MΩ•cm以上の電気抵抗）により精製した水

3.2．    単位の定義 －1ユニットは、pH5.5、25℃において、1分当たり1 μmolの2,2'-アジノ-ビス（3エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸）を酸化します。

3.3．    ABTS - 2,2'-アジノ-ビス（3エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸）。ABTSは、Boehringer Mannheim GmbHの登録商標です。

4．考察

H₂O₂ + ABTS   ^Peroxidase   > 2H₂O+ 酸化ABTS

5．責任

すべての解析担当者は、本プロトコルの記載を遵守する責務を負います。

6．安全性

危険性と適切な取り扱い上の注意事項については、安全データシート（SDS）をご覧ください。

7．手順

7.1．    条件
温度25℃、pH 5.0、A405 nm、光路1 cm

7.2．    方法
連続速度分光光度法

7.3．    試薬

7.3.1.    100 mMリン酸カリウム緩衝液（25℃でpH 5.0）：リン酸一カリウム（製品番号P5379）を用いて13.6 mg/mLの精製水溶液を調製します。1 N KOHを用い、この溶液のpHを、25℃で5.0に調整します。

7.3.2.9.1 mM ABTS（基質）：ABTS（製品番号A9941）を用いて、7.3.1項の試薬で5.0 mg/mL溶液を調製します。この溶液のpHを確認し、必要に応じ、25℃で5.0に調整します。製品番号A9941は、10 mg錠として供給されます。新鮮な溶液を調製します。

7.3.3.0.3% （w/w）過酸化水素溶液（H2O2） ：過酸化水素30% （w/w）溶液（製品番号H1009）を用いて、0.3% （w/w）精製水溶液を調製します。新鮮な溶液を調製します。

7.3.4.0.25% （w/v）ウシ血清アルブミンおよび0.5% （v/v） Triton X-100含有40 mMリン酸カリウム緩衝液（25°CでpH 6.8）（希釈）

7.3.4.1.以下を含む精製水溶液を調製します。

7.3.4.1.1.    5.4 mg/mLリン酸カリウム、一塩基性（製品番号P5379）

7.3.4.1.2.    2.5 mg/mLアルブミン、ウシ、フラクションV 粉末（製品番号A4503）

7.3.4.1.3.    5.0 mg/mL Triton X-100（製品番号T6878）TritonはUnion Carbide Corpの登録商標です。

7.3.4.2.    1 N KOHを用い、この溶液のpHを25℃で6.8に調製します。

7.3.5.    ペルオキシダーゼ酵素溶液（Enzy）

7.3.5.1.    冷却した7.3.4項の試薬を用いて10 mg/mL ペルオキシダーゼ原液を調製します。

7.3.5.2.    用時調製。冷却した7.3.4項の試薬を用いて0.20～0.80 units/mLに希釈します。

7.4．    手順

7.4.1.    ピペットを用いて以下の試薬（mL）を適切なキュベットに加えます。

7.4.2.    キュベットを適切な恒温分光光度計にセットし、約5分間25℃に平衡化させた後、以下を加えます。

7.4.3.    直ちに転倒混和し、A_{405 nm} の増加分を約3分間記録します。最高速度は通常開始後1分以内です。複数の酵素量をテストする場合は、1度に1つずつ行います。

7.4.4.    試験試料およびブランクの両方について、最大線形速度におけるΔA_{405 nm}/分を算出します。

7.5.計算式

7.5.1.	Units/mg（固体） =	（ΔA405 nm/分（試験試料） - ΔA405 nm/分（ブランク）） * 3.05 * DF
		36.8 * 0.05

3.05 = 最終反応量（mL)
    DF = 酵素の希釈係数
    36.8 = 酸化ABTSのA405 nmにおけるmmol吸光係数
    0.05 = 使用した酵素量（mL）

7.6．    最終アッセイ濃度：
反応混合液3.05 mL中の各成分の最終濃度は、96 mMリン酸カリウム、8.7 mM 2,2'-アジノ-ビス（3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸）、0.01% （w/w）過酸化水素、0.004% （w/v）ウシ血清アルブミン、0.008% （v/v） Triton X-100、および0.01 ～ 0.04 unitペルオキシダーゼです。

8．参考文献および付録

8.1．    Keesey, J. (1987) Biochemica Information, First Edition, pp. 58, Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN

8.2．    Pütter, J. and Becker, R. (1983) Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H.U., ed.) 3rd ed., Vol III, pp. 286-293, Verlug Chemie, Deerfield Beach, FL

9．承認

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