Western blotting
Il Western blotting è una tecnica analitica consolidata che permette di rivelare, analizzare e quantificare le proteine. Questo metodo è diffusamente utilizzato per rivelare molecole proteiche specifiche in campioni complessi, come omogenati di tessuto e lisati cellulari. Il Western blotting comporta tipicamente la separazione delle proteine mediante elettroforesi su gel seguita dal trasferimento su una membrana di polivinilidenefluoruro (PVDF) o nitrocellulosa. Dopo il trasferimento, le proteine possono essere colorate per la visualizzazione e identificate direttamente mediante sequenziamento N-terminale, spettrometria di massa o immunorivelazione.
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Nell'immunorivelazione mediante Western blotting le proteine vengono identificate grazie al legame con anticorpi specifici. Generalmente si ricorre a una opportuna combinazione di un anticorpo primario e di un anticorpo secondario coniugato con HRP o AP per la rivelazione chemiluminescente o colorimetrica grazie all'impiego di un substrato appropriato. In alternativa, è possibile utilizzare un anticorpo primario o secondario con marcatura fluorescente per la visualizzazione diretta.
Il Western blotting è ampiamente utilizzato in biochimica per rilevare la presenza di proteine specifiche, determinare l'entità delle modificazioni post-traduzionali, verificare l'espressione proteica nelle applicazioni di clonaggio, analizzare i livelli di espressione di proteinee biomarcatori, nella mappatura degli epitopi anticorpali e per testare i marcatori di patologie in ambito clinico.
La necessità di analizzare simultaneamente più proteine in campioni presenti in quantità limitate ha spinto la ricerca a migliorare la sensibilità e la velocità delle tecniche di blotting. Il double blotting elimina i falsi positivi causati dalle interazioni aspecifiche. Il Far-Western blotting consente la rilevazione di specifiche interazioni proteina-proteina. Il Southwestern blotting si usa per identificare le proteine che interagiscono con specifiche sequenze di DNA. ll blotting multistrip aumenta la produttività riducendo al minimo la variabilità tra un blot e l'altro. Sono in fase di sviluppo nuove tecnologie che consentiranno di ridurre le quantità di proteine necessarie per produrre un segnale e di migliorare le capacità quantitative del Western blotting.
Flusso di lavoro
Elettroforesi su gel
L'elettroforesi su gel delle proteine si usa per separare e risolvere le proteine prima del blotting. La miscela proteica viene fatta correre su un gel di poliacrilammide per separare le proteine in base al loro peso molecolare e alla carica.
Trasferimento su membrana
Le proteine separate sul gel grazie all'elettroforesi vengono immobilizzate mediante trasferimento su una membrana di PVDF o nitrocellulosa. Per trasferire le proteine dal gel alla membrana si sfrutta la corrente elettrica (elettroblotting).
Rivelazione
La proteina bersaglio viene rilevata utilizzando un anticorpo primario in combinazione con un anticorpo secondario coniugato con HRP o AP e un substrato chemiluminescente o colorimetrico appropriato, oppure utilizzando un anticorpo primario o secondario con marcatura fluorescente.
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