Crescita e mantenimento di colture cellulari

Fasi della crescita cellulare

Garantire un'adeguata crescita cellulare è fondamentale per raccogliere dati accurati negli studi basati sulle colture cellulari. Il numero delle cellule può essere calcolato utilizzando un emocitometro oppure un contatore di cellule automatico, che offre conte cellulari più precise.

La crescita cellulare in coltura avviene generalmente in quattro fasi:

1. fase di latenza (lag) – le cellule si stanno adattando alle condizioni di coltura e non si dividono;
2. fase di crescita logaritmica (log) – le cellule si dividono attivamente, è la fase più adatta per valutare la crescita della popolazione cellulare o per raccogliere dati. La fase logaritmica tardiva rappresenta il momento migliore per il passaging (subcoltura) delle cellule;
3. fase di plateau (stazionaria) – quando le cellule si avvicinano al 100% di confluenza la crescita rallenta e, man mano che si accumulano i cataboliti cellulari e le risorse si esauriscono, diventano più suscettibili allo stress o a danni;
4. fase di declino – si assiste a una riduzione della popolazione di cellule vive in quanto predomina la morte cellulare.

Terreni per colture cellulari, supplementi e reagenti

Le cellule in coltura richiedono un adeguato apporto di nutrienti per poter crescere. I terreni per la coltura di cellule di mammifero devono mantenere il pH fisiologico, oltre ad apportare sali, carboidrati, aminoacidi, vitamine, acidi grassi e lipidi, proteine e peptidi, oligoelementi e fattori di crescita bilanciati. Il siero fetale bovino (FBS) è il supplemento di crescita più utilizzato per la coltura delle cellule di mammifero in quanto contiene molti di questi nutrienti essenziali e ne è stato dimostrato il supporto alla crescita di cellule e tessuti in coltura. Per le applicazioni che richiedono terreni definiti o a ridotto contenuto di componenti di origine animale sono disponibili terreni a formulazione xeno-free, a composizione nota e privi di componenti animali.

Poiché spesso i terreni e i supplementi rappresentano anche un fertile nutrimento per la crescita di microbi opportunisti, le colture cellulari richiedono una tecnica asettica e l'osservazione regolare per garantire l'assenza di contaminanti che potrebbero causarne la morte o alterarne la crescita simil-in vivo. Per quanto riguarda i comuni contaminanti microbici non osservabili al microscopio, il ricorso a screening di routine con reagenti per la rilevazione del micoplasma protegge gli ambienti di propagazione delle colture e dei tessuti.  

Le colture di lievito, come quelle di S. cerevisiae e P. pastoris (Pichia), si usano comunemente per gli studi sull'espressione di proteine ricombinanti e sulla funzione genica. I nutrienti fondamentali tipicamente inclusi nella formulazione del terreno di coltura per il lievito sono peptone, estratto di lievito e destrosio o glucosio.

Consigli e suggerimenti pratici per la suddivisione delle cellule (passaging)

Ambienti e materiali per colture cellulari

Le cellule in coltura vengono coltivate e manipolate utilizzando materiali in plastica sterile monouso, come fiasche, piastre multipozzetto, pipette sierologiche, unità filtranti sterili da bottiglia e filtri sterili da siringa. Le fiasche e le piastre in materiale plastico usate per la coltura di tessuti sono generalmente trattate in modo da fornire una superficie idrofila che faciliti l'adesione delle cellule aderenti. In alternativa alle classiche superfici 2D, le piastre a membrana microporosa forniscono un ambiente di crescita più fisiologico per le analisi cellulari complesse, come la migrazione cellulare, la comunicazione tra cellule e la polarizzazione cellulare.

La temperatura e l'ambiente gassoso in cui vanno mantenute le cellule in coltura devono ricreare le condizioni presenti nell'organismo da cui derivano. I supporti contenenti cellule e terreni sono quindi solitamente mantenuti all'interno di incubatori dotati di un controllo preciso della temperatura e delle miscele di gas. Tuttavia, i sistemi di incubazione da banco su piccola scala che impiegano la microfluidica e facilitano l'imaging delle cellule in una coltura ininterrotta presentano le condizioni ambientali più autentiche per i modelli predittivi in vitro.