Hibaelhárítás molekuláris klónozáshoz

A molekuláris klónozás áttekintése

A molekuláris klónozást rekombináns DNS-molekulák összeállítására és a gazdaszervezeten belüli replikációjuk irányítására használják, több DNS-molekulát létrehozva. A klónozás során egy molekula replikációjával azonos DNS-molekulákkal rendelkező sejtpopulációt állítanak elő. Általában egész géneket vagy bármilyen DNS-szekvenciát (például promótereket, nem kódoló szekvenciákat és véletlenszerűen töredezett DNS-t) tartalmazó DNS-töredékek felerősítésére használják. A molekuláris klónozás az a folyamat, amelynek során az érdekes gént (GOI) egy plazmidvektorba illesztik, majd ezt a vektort beillesztik egy olyan sejtbe, amely kifejezi a GOI által kódolt fehérjét. Miután a fehérje kifejeződik a sejtben, a fehérje kifejeződése felhasználható különböző vizsgálatokra (például a sejtek jelátvitelére, morfológiájára vagy más szempontokra).

A klónozás nem csak egy gén vagy más sejtkomponens másolatainak létrehozását jelenti, hanem egy gén megváltoztatását egy DNS-szekvencián belül, majd annak replikálását. Ahhoz, hogy egy élő szervezetben bármilyen DNS-szekvenciát fel lehessen sokszorozni, a szekvenciának kapcsolódnia kell egy replikációs eredethez, és képesnek kell lennie arra, hogy irányítsa saját maga és bármely kapcsolódó szekvencia szaporodását (például: Rapid DNA Dephos &; Ligation Kit használható klónozásra).

A molekuláris klónozás jelentősége/alkalmazása

A molekuláris klónozást a következőkre használják:

• A fehérjék és funkciójuk feltárására használják. A rekombináns DNS segítségével a kutatók irányíthatják a replikációt (rekombináns fehérjék előállítását) és manipulálhatják a sejteket a klónozással, ezáltal többet tudhatnak meg bizonyos fehérjékről, és ezt a tudást nagyobb léptékű kutatási törekvésekben, például betegségek és kórokozók esetében alkalmazhatják.¹
• Segítségével számos különböző faj (beleértve az embert és más állatokat is) genomszekvenciájának feltárása és olyan transzgenikus organizmusok létrehozása lehetséges, mint a gyomirtószereknek ellenálló növények stb.
• A sejtciklus, a genomszervezés, a génexpresszió és a génterápia területén használják. Hasznos továbbá új gyógyszerek felfedezésében és új rekombináns vakcinák szintézisében is.
• Egyszerűsége, költséghatékonysága, gyorsasága és megbízhatósága miatt fontos eszközként működik a klinikai mikrobiológiában. E technológia ipari alkalmazása új antibiotikumok előállításához vezet antimikrobiális peptidek és rekombináns citokinek formájában, amelyek terápiás szerekként használhatók.¹
• Ezt a technológiát felhasználva génszondákat fejlesztenek ki, amelyeknek számos hasznos szerepük van az örökletes betegségek korai diagnózisában, a törvényszéki vizsgálatokban és a rutin diagnosztikában.¹

A molekuláris klónozás folyamata

Minden DNS-töredék klónozása lényegében a következő lépésekből áll:

• A klónozó vektor kiválasztása (például: PSF-OXB20-FLUC - BAKTERIÁLIS LUCIFERÁZIS PLASMID vagy >.PSF-OXB20-BETAGAL - BAKTERIÁLIS BETA GALACTOSIDASE PLASMID vagy PSF-OXB20 - STRONG BACTERIAL PROMOTER PLASMID és gazdaszervezet. A vektor kiválasztásához segítséget nyújt a Expressziós vektor kiválasztási útmutató
  
• Vektor DNS előkészítése (pl: GenElute™ Plasmid Midiprep Kit/a>, Plasmid DNS E. coli RRI)
• Klónozandó DNS-fragmentum előállítása
• Rekombináns DNS létrehozása DNS-ligázzal (például: T4 DNS-ligáz)
• A rekombináns DNS bevitele vagy beillesztése a gazdaszervezetbe:
• A DNS bevitele a gazdaszervezetbe a választott kísérleti módszertől függ (i.pl. transzformáció, transzdukció, transzfekció, elektroporáció)
• A vektorszekvenciákat tartalmazó szervezetek kiválasztása
• A kívánt DNS-betétekkel rendelkező és biológiai tulajdonságokkal rendelkező klónok szűrése

A molekuláris klónozásról szóló részletes cikk a Molekuláris biológia kézikönyv.

A molekuláris klónozás során különböző problémákkal szembesülünk, amelyeket ellenőrizhetünk. Az alábbiakban néhány lehetséges okot és ajánlott megoldást mutatunk be:

Vektor kiválasztása

A klónozás során vegye figyelembe ezt a négy DNS-szegmenst; bármelyik DNS-szegmens hiánya problémákat okozhat:

• Egy DNS-replikációs origó elengedhetetlen (a gazdaszervezeten belüli replikációhoz)
• Egy vagy több egyedi restrikciós endonukleáz felismerőhely (ahová idegen DNS-t lehet bejuttatni)
• Egy szelektálható genetikai markergén, amely a vektorszekvenciákat felvett sejtek túlélését teszi lehetővé
/li>
• Egy további gén (az idegen DNS-t tartalmazó sejtek szűrésére szolgál)

DNS-fragmentumok előállítása

Teljesen nem teljes restrikciós enzim (RE) emésztés

• A nem teljesen hasító restrikciós enzim(ek): Ellenőrizni kell az enzim(ek) metilációs érzékenységét, használja a restrikciós enzimhez mellékelt ajánlott puffert. A DNS megtisztítása az enzimet gátló szennyeződések eltávolítása érdekében. (Használhatja a következő termékeket a jobb eredmények érdekében)
  
• Só gátlás: Néhány enzim sóérzékeny, ezért a DNS-t emésztés előtt meg kell tisztítani.
• PCR komponensek gátlása: Meg kell tisztítani a PCR fragmentumot a restrikciós emésztés előtt.
• Nem megfelelő puffer használata: Csak a restrikciós enzimmel együtt szállított ajánlott puffert kell használni. (Kettős emésztés: A DNS-szubsztrát egyidejű feltárását két restrikciós enzimmel kettős emésztésnek nevezik, és ez egy gyakori időmegtakarítási eljárás) A kettős emésztéshez olyan megfelelő puffert kell választani, amely mindkét enzim számára a legnagyobb aktivitást eredményezi. Az ajánlott protokollt kell követni. Ha két különböző inkubációs hőmérsékletre van szükség, akkor az optimális reakciópuffert kell kiválasztani, és a reakciót ennek megfelelően kell beállítani.
• Túl kevés enzimegység használata esetén: Általában legalább 3-5 egység enzim használata ajánlott μg DNS-enként.
• Rövid inkubációs idő: Meg kell növelni az inkubációs időt.

A feltárt DNS kenetként futott agaróz gélen.

• A restrikciós enzim(ek) esetleg a DNS-szubsztráthoz kötődtek: SDS 0 hozzáadására van szükség.1-0,5% (például: Nátrium-dodecil-szulfát oldat) a betöltő pufferhez, hogy az enzim disszociáljon a DNS-ről.
• Nukleázszennyezés: Friss, tiszta futtató puffer és friss agarózgél (például: Agaróz, alacsony gélesedési hőmérséklet) használata segíthet, valamint a DNS megtisztítása.

Extra sávok vagy elkenődés a gélen

Ha a vártnál nagyobb sávok jelennek meg a gélen, ez az enzim(ek) szubsztráthoz való kötődésére utalhat: Lehet, hogy csökkenteni kell az egységek számát a reakcióban, és segíthet 0,1-0,5% SDS (például: Nátrium-dodecil-szulfát-oldat) hozzáadása a töltőpufferhez az enzimnek a szubsztráttól való disszociációja érdekében.

A lágyítási hőmérséklet túl alacsony lehet: Meg kell határozni a primerek megfelelő lágyítási hőmérsékletét. (Pl: KiCqStart^® SYBR^® Green Primer, Hexanucleotide Primers használható).

Nem amplifikálódik a PCR fragmentum

Ez a következő okok miatt következhet be, amelyeket a kísérlet során ellenőrizni kell²:

• Nem megfelelő primer szekvencia használata vagy hiba a PCR primerekben
• Nem megfelelő lágyítási és hosszabbítási hőmérséklet
• Nem megfelelő primerkoncentráció és túl kevés egység polimeráz: A gyártó által ajánlott primerkoncentrációt és polimeráz egységeket kell használni a reakció térfogata alapján.
• Mg²⁺ koncentrációk, puffer pH és ciklikus körülmények a reakcióban:  Nagyfokú optimalizálásra van szükség az amplifikációs reakcióhoz.

Rekombináns DNS létrehozása DNS-ligáz használatával

• A maximális ligációs keverék használata: A transzformációhoz a ligációs reakció ajánlott mennyiségét kell használni. (Pl: QuickLink™ DNA Ligation Kit és Rapid DNA Ligation Kit nagy hatékonyságú és gyors ligáláshoz használható.
• Eredménytelen ligálás: Erősítse meg, hogy legalább egy olyan fragmentumot kell ligálni, amely 5´ foszfátrészt tartalmaz. Tisztítsa meg a DNS-t, hogy eltávolítsa a szennyeződéseket, például a sót és az EDTA-t. A ligálás előtt távolítsa el a foszfatázt. A ligáz aktivitásának megerősítése egy ligációs kontroll elvégzésével segíthet.
• Nem hatékony foszforiláció:  A DNS-t a foszforiláció előtt tisztítani kell a felesleges só, foszfát vagy ammóniumionok eltávolítása érdekében, amelyek gátolhatják a kinázt.
• Nem hatékony tompítás: A tompítás előtti hőinaktiválás vagy a restrikciós enzimek eltávolítása és a PCR-fragment tompítás előtti tisztítása segíthet.
• Nem hatékony A-farok: A PCR tisztítására van szükség az A-tailing előtt. A nagy hűségű enzimek eltávolítják a nem-templált nukleotidokat)

A ligált DNS kenetként futott agaróz gélen

• A ligáz a DNS-szubsztráthoz kötődik: A ligációs reakciót gélen való futtatás előtt Proteináz K-val (például: Proteináz K a Tritirachium albumból) kell kezelni.

A rekombináns DNS beillesztése a gazdaszervezetbe

• Ha a sejtek nem életképesek: Ki kell számítani a kompetens sejtek transzformációs hatékonyságát, vagy a kereskedelemben kapható nagy hatékonyságú kompetens sejteket kell használni. Például: SIG10 kémiailag kompetens sejtek (CMC0001) nagy transzformációs hatékonysággal rendelkeznek, amely >1 x 10⁹ cfu/μg
• A sejtek számára toxikus lehet az érdeklődésre számot tartó gén (GOI): A lemezeket alacsonyabb hőmérsékleten kell inkubálni, vagy olyan törzset kell használni, amely erősebb transzkripciós kontrollt gyakorol a DNS-töredék vagy az érdeklődésre számot tartó gén felett. Például: CONTROLLER SIG10 kémiailag kompetens sejtek használható.
• Ha rossz hősokk protokollt használunk (kémiailag kompetens sejtekhez): Követni kell a gyártó specifikus transzformációs protokollját, és az ajánlott hőmérséklet használata a hősokk során hasznos lesz.
• Ha PEG van a ligációs keverékben (elektrokompetens sejtek esetében): Szükséges a DNS tisztítása cseppdialízissel a transzformáció előtt.
• Ha nincs regisztrált feszültség elektrokompetens sejtek esetén: A DNS-t a ligációs lépés előtt meg kell tisztítani, és el kell távolítani a légbuborékokat. Követni kell a gyártó által megadott elektroporációs paramétereket.
• A konstruált DNS túl nagy: Olyan kompetens sejttörzset kell választani, amely hatékonyan transzformálható nagy DNS-konstrukciókkal, vagy az elektroporáció alkalmazása segíthet. Például: XLDNA SIG10 elektrokompetens sejtek nagyméretű konstrukciókhoz és a DNS-hozam növeléséhez használható.
• Konstruáljon olyan DNS-fragmentumot, amely rekombinációra hajlamos lehet:  Ellenőrizni kell. Például: Kémiailag kompetens sejtek használható.
• A vektorszekvenciát tartalmazó szervezetek szelekciójához egy szelektálható marker (általában egy gén elengedhetetlen), amely rezisztenciát kölcsönöz egy antibiotikummal szemben.
  Nem megfelelő antibiotikum vagy annak koncentrációja: Meg kell erősíteni az antibiotikumot és optimalizálni kell a koncentrációját. A vektorhoz használt szelekciós markert is meg kell erősíteni. Például Hygromycin B from Streptomyces hygroscopicus használható markerként. Az alábbi táblázatban néhány példát talál az antibiotikumokra, valamint azok munkakoncentrációjára.

A Hibaelhárítási útmutatóban bemutatott lehetséges okokon kívül a következő problémák is összefüggésbe hozhatók az alacsony vagy semmilyen átalakítási hatékonysággal, és ellenőrizhetők.

• Szennyeződések a DNS-ben: A DNS-oldatból el kell távolítani a fenolt, a fehérjéket, a detergenseket és az etanolt, ha kémiailag kompetens sejteket használunk (i.pl.  BL21(DE3)). Az etanol a ligálás során kicsapódik a plazmid DNS megtisztításához, ha elektrokompetens sejteket használunk, ill. BL21(DE3)   (mivel a só és a pufferek erősen gátolják az elektroporációt és növelik az ívek kialakulásának kockázatát). A DNS-t steril vízben is fel lehet oldani a további szennyeződések ellenőrzésére.
• Többlet DNS vagy térfogat: Ezt ellenőrizni kell, és csak az ajánlott térfogatot kell elkészíteni a használt sejttípustól függően.
• Az antibiotikum-rezisztencia alacsony vagy gyenge expressziója: LB táptalaj helyett S.O.C. táptalaj ajánlott az expresszióhoz, mivel ez 2-3-szorosára csökkenti a transzformáció hatékonyságát.
• A kompetens sejtek nem megfelelő tárolása és kezelése: A kompetens sejteket -80 °C-on és nem folyékony nitrogénben kell tárolni. A kompetens sejteket felolvasztásuk után azonnal fel kell használni, és felhasználásig jégen, hidegen kell tartani őket. Minimalizálja a fagyasztási-olvasztási ciklusok számát.
• A sejtek lassú vagy egyáltalán nem növekednek, illetve túlszaporodnak: Az ajánlott hőmérséklet alkalmazása segíthet a sejtek megfelelő növekedésében. Túlnövekedés esetén különös figyelmet kell fordítani a használt antibiotikumra és annak koncentrációjára.
• Téves számítások: Győződjön meg arról, hogy a hatékonyság kiszámításához a megfelelő hígítási tényezőket és DNS-mennyiségeket használja.

Klónszűrés

Plazmid nélküli kolóniák:

• Elégtelen mennyiségű antibiotikum használata:  A lemezeken lévő antibiotikum mennyiségét az ajánlott mennyiségre kell emelni, és friss lemezek használata friss antibiotikummal segíthet. Kérjük, olvassa el az 1. táblázatot.
• Szatellita telepek kiválasztása: Nagy, jól megalapozott telepeket kell kiválasztani a további elemzéshez.
  (A szatellit telepek nagyon kicsi sejtkolóniák, amelyek egy antibiotikum-rezisztens kolónia körül nőnek, és felvették a rossz plazmidot. Az antibiotikum-rezisztens kolónia olyan enzimeket bocsát ki, amelyek lebontják az antibiotikumot. A szatellita kolóniák nem nőnek, ha friss táptalajba helyezzük át őket, ezért a további elemzés során nem vesszük figyelembe őket.)

A rossz/helytelen konstrukciót tartalmazó kolóniák oka lehet:

• A plazmid (vektor)
• A klónozás során használt helytelen PCR-amplikon: A PCR körülményeket optimalizálni kell. 
• Belső felismerőhely jelenléte: Elemezni kell az inzert szekvenciáját a belső felismerőhely jelenléte szempontjából.
• Mutációk/hiba jelenléte a szekvenciában:
  • alacsony hűségű DNS-polimeráz használata: Használjon nagy hűségű DNS-polimerázt, például Proofreading aktivitással: A szekvenálási reakció további újrafuttatása hasznos lehet.
  • A gélből való kivágás során UV-fény által károsodott DNS: A DNS agaróz gélből történő kivágása során hosszú hullámhosszú UV (360 nm) fényszóró használata ajánlott.

Figyelembe vétel a PCR-klónozáshoz

• A felhasznált inzert vagy fragmentum jellege: A PCR-fragmentum hatékonysága a fragmentum mérete, az inzert toxicitása és az inzert összetettsége miatt eltérő.
• Inzert mérete: A nagy hatékonyság érdekében a kis DNS-fragmentumokat vesszük figyelembe.
• Vektor és inzert aránya:  A hatékony klónozáshoz nagyon lényeges és kritikus a vektor és az inzert moláris koncentrációs arányának optimalizálása.
• Tiszta PCR-termék használata: Ajánlott a tiszta PCR-termék használata, és bizonyos esetekben a friss termék használata hasznos. (Például: rAPid alkalikus foszfatáz használható a PCR-termék tisztítására a dNTP-k eltávolításával).
• Pozitív és negatív kontrollok használata: A klónozás eredményeinek értékeléséhez elengedhetetlen a megfelelő pozitív és negatív kontroll.
• Vektor és inzert DNS-végének kompatibilitása: Ezt ellenőrizni kell, és a sikeres klónozáshoz fontos a megfelelő polimeráz használata a klónozó vektorral. A SnapFast™ vektor használata hatékony és egyszerű klónozást tesz lehetővé, mivel a DNS egyik vektorból a másikba történő átvitelét megkönnyíti. Kompatibilis számos, már létező klónozó vektorral és számos shuttle vektorral, így megkönnyíti a génátvitelt nagy sikerarányokkal.
• Az előre- és fordított PCR primerek, valamint a szondák megfelelő megtervezése kulcsfontosságú.³

Hivatkozások

1. Sharma K, Mishra AK, Mehraj V, Duraisamy GS. 2014. Advances and applications of molecular cloning in clinical microbiology. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 30(1):65-78. https://doi.org/10.1080/02648725.2014.921501

2. Roux KH. 2009. Optimization and Troubleshooting in PCR. Cold Spring Harbor Protocols. 2009(4):pdb.ip66-pdb.ip66. https://doi.org/10.1101/pdb.ip66

3. Raso A, Mascelli S, Nozza P, Ugolotti E, Vanni I, Capra V, Biassoni R. 2011. Troubleshooting fine-tuning procedures for qPCR system design. J. Clin. Lab. Anal.. 25(6):389-394. https://doi.org/10.1002/jcla.20489

4. Canene-Adams K. 2013. Explanatory Chapter.271-278. https://doi.org/10.1016/b978-0-12-418687-3.00022-7

5. Lorenz TC. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. JoVE.(63): https://doi.org/10.3791/3998

6. Fulton TL, Stiller M. 2012. PCR Amplification, Cloning, and Sequencing of Ancient DNA.111-119. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-516-9_15

7. Mergulhão F, Kelly A, Monteiro G, Taipa MA, Cabral JM. Troubleshooting in Gene Splicing by Overlap Extension: A Step-Wise Method. MB. 12(3):285-288. https://doi.org/10.1385/mb:12:3:285

Kérjük, lépjen kapcsolatba technikai támogatásunkkal, ha a klónozási probléma továbbra is fennáll.