Biofarmáciai jellemzés

Biológiai gyógyszerek, biohasonló készítmények jellemzése és elemzése

A biológiai gyógyszerek elemzéséhez és jellemzéséhez rendkívül kifinomult analitikai munkafolyamatokra van szükség, amelyek jelentős hangsúlyt fektetnek a GMP és a jogszabályi megfelelésre. Mind  egy eredeti bioterápia, mind egy biohasonló fejlesztése termékkarakterizációs vizsgálatokat igényel a robusztus és jól specifikált biológiai gyógyszer biztosítása érdekében.

Identitás

Intact tömeg meghatározása

Az intakt molekulatömeg meghatározása, amelyet gyakran SEC-MS és megfelelő standardok segítségével végeznek, szükséges lépés a biológiai gyógyszerek jellemzésében, a klónok kiválasztásától a végtermék ellenőrzéséig. Az intakt molekulatömeg-elemzést általában a fehérje/peptidtermékek sokféleségének kimutatására és a biotermékek azonosságának igazolására használják. Optimalizálással az összes fehérjetermék intakt molekulatömegét is meg lehet határozni, beleértve a bispecifikus monoklonális antitesteket is.

Ahelyett, hogy egy nagy fehérje biotermék nehézkes intakt tömegével kellene foglalkozni, egy fehérje emésztéses analízis megközelítést alkalmaznak, ahol a mintát először csak néhány fragmentumra hasítják, majd az elválasztás után a szétválasztás egyedileg kezelhető speciális tömegspektrométeres proteomikai standardokkal.

Titermérés

A sejtvonal termelékenysége a megfelelő mennyiségű mAb előállítására, befolyásolja annak kereskedelmi potenciálját. Az alapszintű mérésként használt titer mérése Protein-A affinitáskromatográfiával (HPLC) történik. A mAb fejlesztése során kezdetben nagyszámú terméssejtkultúra (HCC) mintát kellett szűrni IgG-titer szempontjából. Affinitás kromatográfiát Protein-A ligandumot alkalmazva gyakran használják a mAb koncentrációjának meghatározására, valamint tisztítására a downstream aggregátum- és töltésváltozat-elemzéshez.

Aminosav-analízis

Aminosav-analízis a termékazonosság megállapításának népszerű módja, és a mAb aminosav-összetételének meghatározására használják. Gyakran végzik az extinkciós együttható mérésével együtt, amely a különböző gyártmányok közötti titer megállapítására rutinszerűen alkalmazott módszer.

A metrológiailag érvényes eljárásokkal kijelölt értékekkel rendelkező hitelesített referenciaanyagok kritikus fontosságúak lesznek az aminosav-analízis munkafolyamatának minden lépése során, beleértve a fehérjeextrakciót, frakcionálást, dúsítást, proteolízist és elemzést, a kísérleti eltérések minimalizálása és ellenőrzése érdekében.

Peptidtérképezés

A mAb azonosságának megállapításához elegendő lehet az egyszerű, egyetlen enzimet tartalmazó peptidtérképek összehasonlítása. A részletesebb terápiás antitest jellemzés, beleértve az N- vagy C-terminális szekvenálást, a glikánok jellemzését, valamint az antitestgyártás, -elemzés, -tisztítás és -fragmentálás egyéb szempontjait, jobban tájékoztathat a terméktervezésről. Proteomikai tömegspektrometria további szerkezeti információkat nyújt.

Poszt-transzlációs módosítás

N-glikánelemzés

A nagymértékben változó glikoziláció hatással lehet a mAb tisztaságára és változó funkciót eredményezhet. A monoklonális antitestek N-glikánokat hordoznak a gerincükön, amelyek LC-MS segítségével felszabadíthatók a glikozilációs mintázatok értékeléséhez. A monoklonális antitestek N-glikánjainak jellemzése szükséges, hogy a vizsgált molekula teljes szerkezeti részleteit megismerjük. Ezeknek az N-glikán útvonalaknak a megértése azért fontos, mert az N-glikánok a glikoproteinek számos tulajdonságát befolyásolják, beleértve a glikánok konformációját, oldhatóságát, antigenitását és glikánkötő fehérjék általi felismerését.

Monoklonális antitestek (mAb-k) magasabb rendű szerkezetének (HOS) összehasonlítása

A HOS-t - a mAb 3D szerkezetét - számos tényező befolyásolja, kezdve a mAb előállításához használt sejtvonal kiválasztásától a biológiai feldolgozási körülményekig, mint például a hőmérséklet, a pH és a fényexpozíció. A hidrogén-deutériumcsere tömegspektrometria (HDX-MS) egy olyan módszer, amelyet a mAb tercier szerkezetének részletes megismerésére alkalmaznak.

mAb módosítások elemzése

A mAb gyártási folyamat során számos különböző poszttranszlációs módosítás történhet, amelyeket nagyban befolyásolnak az olyan folyamatparaméterek, mint a közeg, a hőmérséklet stb. A konzisztens termék előállítása érdekében kritikus fontosságú, hogy ezeket a módosításokat a mAb szintézis minden egyes fordulója során reprodukáljuk. Modifikációs elemzés magában foglalja a diszulfidhidak feltérképezését és a glikán alapszerkezetének értékelését. A szialilációt is célszerű számszerűsíteni, mivel a szialinsav negatív hatással lehet a mAb-re.

mAb töltéseloszlás

A poszttranszlációs módosítások (PTM) vagy kémiai módosítások eredményeként a töltésváltozatok jelentős hatással lehetnek a mAb biológiai aktivitására és farmakokinetikájára. A mAb-kre vonatkozó szabályozási követelmény, a töltésváltozatok elemzése olyan technikákkal értékelhető, mint a kationcserés kromatográfia (CEX) és a kapilláris izoelektromos fókuszálás (cIEF).

mAb Fizikai vizsgálat és méreteloszlás

mAb fizikai vizsgálata

A fizikai vizsgálat a mAb megjelenésének jellemzésére szolgál, például a pH, az ozmolalitás és a koncentráció mérése. A csomagolás integritását is értékelik a fizikai vizsgálati protokollon belül, például Karl Fischer-féle nedvességelemzéssel vagy festék bejutásával a zárás integritásának megerősítésére.

HmAb méreteloszlás

Míg az egységes mAb termék kívánatos, a kezdeti gyártási anyag gyakran tartalmaz méretváltozatokat, például aggregátumokat, fragmentumokat és további könnyű láncokat mutató biomolekulákat. Mivel ezek potenciálisan befolyásolhatják az immunogenitást és a hatékonyságot, fontos jelenlétük nyomon követése. A méretkizárásos kromatográfia (SEC) a leggyakrabban használt módszer a méreteloszlás értékelésére. 

Szilárdság és szennyeződések

Host-cell protein szennyeződések

.A bioterápiákban PPM-szinten jelenlévő gazdasejtfehérje (HCP) szennyeződések jelentős immunogenitási kockázatot jelentenek, mivel kiszámíthatatlan immunválaszt válthatnak ki a betegekben. Összetett és változatos természetük miatt nehéz kimutatni vagy nyomon követni őket. Míg a legtöbb HCP szennyeződés hatékonyan eltávolítható a tipikus tisztítási folyamatok során, a HCP-k egy kis populációja különösen nagy kihívást jelent. Egy nehezen eltávolítható CHO HCP, a lipoprotein lipáz koppintását fejlesztették ki a monoklonális antitest formulákban a poliszorbát stabilitásának javítása érdekében.

Gyártási adalékanyagok ellenőrzése

A mAb-fejlesztés és -gyártás során a gyártási adalékanyagok széles skáláját kell ellenőrizni, beleértve Tisztítószerek, Protein A, Transzfekciós reagensek, antibiotikumok, habzásgátlók és növekedési faktorok.

mAbs mikrobiológiai vizsgálatok

A GMP és a GMP-nek megfelelő gyógyszerfejlesztéshez és -gyártáshoz számos mikrobiológiai vizsgálati eljárás szükséges. Számos mAb-t mikroorganizmusokban állítanak elő, hogy kihasználják gyors növekedési sebességüket és nagy hozamukat, ezért kritikus fontosságú a mikrobiális szennyeződések jelenlétének nyomon követése és ellenőrzése. A Gram-negatív baktériumok sejtfalának endotoxinnak nevezett összetevője a láztól és hidegrázástól a halálos szeptikus sokkig terjedő reakciókat vált ki, ami a pyrogén kimutatását (MAT in vitro tesztelés) és az azt követő eltávolítását a mAb-ból kulcsfontosságúvá és szabályozási követelménnyé teszi. Bioburden tesztelést kell alkalmazni a teljes mAb gyártási folyamat során a potenciálisan káros mikrobiális szennyeződések jelenlétének ellenőrzésére. Sterilitásvizsgálat szintén kritikus a mAb gyártás integritásának megerősítéséhez.