Caracterização de produtos biofarmacêuticos

Caracterização e análise de biológicos e biossimilares

Os medicamentos biológicos exigem fluxos de trabalho analíticos altamente sofisticados para sua análise e caracterização com ênfase significativa em BPF e conformidade regulatória. O desenvolvimento de uma bioterapia original ou de um biossimilar requer estudos de caracterização de produtos para garantir a obtenção de um medicamento biológico robusto e bem especificado.

Identidade

Determinação de massa intacta

A determinação de massa molecular intacta, muitas vezes realizada com SEC-MS e padrões adequados, é uma etapa necessária na caracterização de biológicos, desde a seleção de clones até a verificação do produto final. A análise de massa molecular intacta é comumente usada para demonstrar a diversidade dos produtos proteicos/peptídicos e verificar a identidade dos biológicos. Com a otimização, também é possível determinar o peso molecular intacto de todos os produtos proteicos, inclusive de anticorpos monoclonais biespecíficos.

Em vez de lidar com a massa intacta difícil de um grande biológico proteico, uma abordagem de análise de digestão de proteínas é usada onde a amostra é primeiramente clivada em apenas alguns fragmentos e, em seguida, a separação pode ser feita individualmente com padrões proteômicos especializados de espectrometria de massa.

Medição de título

A produtividade da linhagem celular para fornecer quantidades suficientes de mAb influencia seu potencial comercial. Usado como uma medida de referência, o título é medido usando cromatografia de afinidade à proteína A (HPLC). Inicialmente, no desenvolvimento de um mAb, um grande número de amostras coletadas de culturas celulares (do inglês, HCC) precisava ser examinado para determinar o título de IgG. A cromatografia de afinidade empregando um ligante de proteína A é frequentemente usada para determinar a concentração de mAb, bem como para purificá-lo para análise de agregados e variantes de carga downstream.

Análise de aminoácidos

A análise de aminoácidos é uma maneira popular de determinar a identidade do produto e é usada na determinação da composição de aminoácidos de um mAb. Muitas vezes é realizada juntamente com uma medição do coeficiente de extinção, um método rotineiramente empregado para definir o título entre diferentes produções.

Materiais de referência certificados com valores atribuídos por procedimentos metrologicamente válidos serão fundamentais para minimizar e controlar as variações experimentais em todas as etapas do fluxo de trabalho de análise de aminoácidos, incluindo extração de proteínas, fracionamento, enriquecimento, proteólise e análise.

Mapeamento de peptídeos

Para obter uma indicação da identidade do mAb, a comparação de mapas de peptídeos de enzimas simples e únicas pode ser suficiente. A caracterização de anticorpos terapêuticos mais detalhada, incluindo o sequenciamento da terminação N ou C, caracterização de glicano e outros aspectos da produção, análise, purificação e fragmentação de anticorpos, pode fornecer mais informações sobre a engenharia do produto. A espectrometria de massa proteômica fornece informações estruturais adicionais.

Modificação pós-traducional

Análise de N-glicanos

A glicosilação altamente variável pode impactar a pureza do mAb e produzir função variável. Os anticorpos monoclonais possuem N-glicanos em sua estrutura que podem ser liberados usando LC-MS para avaliar os padrões de glicosilação. A caracterização dos N-glicanos a partir de um anticorpo monoclonal é necessária para fornecer detalhes estruturais completos da molécula sob investigação. Entender essas vias do N-glicano é importante porque eles afetam muitas propriedades das glicoproteínas, incluindo sua conformação, solubilidade, antigenicidade e reconhecimento por proteínas de ligação a glicanos.

Comparação da estrutura de ordem superior (do inglês, HOS) dos anticorpos monoclonais (mAbs)

Muitos fatores influenciam a HOS – a estrutura 3D de um mAb – desde a escolha da linhagem celular para produção de mAb até as condições de bioprocessamento, como temperatura, pH e exposição à luz. A espectrometria de massa com troca de hidrogênio por deutério (HDX-MS) é um método utilizado para obter uma visão detalhada da estrutura terciária do mAb.

Análise de modificação de mAb

Muitas modificações pós-tradução diferentes podem ocorrer durante o processo de fabricação de mAbs, que são bastante influenciados por parâmetros de processo, como meios, temperatura etc. Para produzir um produto consistente, é essencial que essas modificações sejam reproduzidas durante todas as rodadas de síntese de mAb. A análise de modificação inclui mapeamento de pontes dissulfeto e avaliação da estrutura básica de glicano. Também é recomendável quantificar a sialilação, pois o ácido siálico pode ter um efeito negativo sobre o mAb.

Distribuição da carga de mAb

Como resultado das modificações pós-traducionais (do inglês, PTMs) ou modificações químicas, as variantes de carga podem ter um impacto considerável na atividade biológica e farmacocinética de um mAb. Sendo um requisito regulatório para mAbs, a análise de variante de carga pode ser efetuada por meio de técnicas que incluem cromatografia de troca catiônica (CEX) e focalização isoelétrica capilar (cIEF).

Teste físico e distribuição de tamanho de mAb

Testes físicos de mAb

Os testes físicos são usados para caracterizar o aspecto de um mAb, como por exemplo, medição de pH, osmolalidade e concentração. A integridade da embalagem também é avaliada dentro dos protocolos de testes físicos, por exemplo, usando a análise de umidade pelo método de Karl Fischer ou a entrada de corante para confirmar a integridade da tampa.

Distribuição de tamanho de HmAb

Embora um único produto mAb seja desejado, o material de produção inicial geralmente contém variantes de tamanho, como agregados, fragmentos e biomoléculas que exibem cadeias leves adicionais. Como elas têm o potencial de afetar a imunogenicidade e potência, é importante monitorar sua presença. A cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) é o método mais usado para avaliar a distribuição de tamanho. 

Esterilidade e impurezas

Impurezas de proteínas de células hospedeiras

As impurezas de proteínas de células hospedeiras (do inglês, HCP), presentes nos níveis de ppm nas terapias biológicas, são um grande risco de imunogenicidade porque podem provocar uma resposta imune imprevisível nos pacientes. Sua natureza complexa e diversificada faz com que seja difícil detectá-las ou monitorá-las. Embora a maioria das impurezas de HCP seja eficazmente removida em processos típicos de purificação downstream, uma pequena parcela de HCPs é particularmente desafiadora. Foram desenvolvidas formas de eliminação de uma HCP de CHO (lipoproteína lipase) difícil de remover para propiciar uma melhor estabilidade do polissorbato em formulações de anticorpos monoclonais.

Monitoramento de aditivos de fabricação

Uma ampla variedade de aditivos de fabricação deve ser monitorada durante o desenvolvimento e a fabricação de mAbs, incluindo detergentes, proteína A, reagentes de transfecção, antibióticos, agentes antiespumantes e fatores de crescimento.

Testes microbianos de mAbs

Vários procedimentos de testes microbianos são necessários para o desenvolvimento e fabricação de medicamentos em conformidade com as BPF. Muitos mAbs são produzidos em microrganismos para se beneficiar de suas taxas rápidas de crescimento e altos rendimentos, tornando essencial monitorar e controlar a presença dos contaminantes microbianos. Um componente da parede celular de bactérias gram-negativas, chamado endotoxina, provoca respostas que variam desde febre e calafrios até choque séptico fatal, tornando cruciais e um requisito regulatório a detecção de pirogênios (teste MAT in vitro) e sua subsequente remoção do mAb. Os testes de biocarga devem ser empregados durante todo o processo de fabricação de mAb para monitorar a presença de contaminação microbiana potencialmente prejudicial. Os testes de esterilidade também são fundamentais para confirmar a integridade da produção de mAb.