Marcação e detecção de ácidos nucleicos

Marcação e sondas de ácidos nucleicos

Os ácidos nucleicos podem ser marcados ao longo de toda a molécula ou nas extremidades 5’ e 3’. Sondas de ácidos nucleicos são especialmente úteis para ensaios de hibridização, como a detecção de RNA por northern blot ou de DNA por southern blot. Várias metodologias de marcação são usadas para distribuir o marcador ao longo da sonda, incluindo PCR com desoxinucleotídeos marcados (dNTPs) ou trifosfatos de nucleotídeos (NTPs) marcados, priming aleatório e tradução de cortes ("nicks"). A marcação nas extremidades é especialmente útil para ensaios que investigam interações entre ácidos nucleicos e proteínas para evitar o bloqueio estérico.

Ensaios de marcação e detecção de ácidos nucleicos

Dependendo do método de marcação, a detecção colorimétrica é usada com frequência para sondas com marcador enzimático, enquanto a detecção autorradiográfica é adequada para sondas radioativas. Sondas comuns incluem sondas com marcador digoxigenina (DIG) e fluoresceína e podem ser usadas em combinação para facilitar a detecção de sonda multicolorida quando acopladas a reações colorimétricas (p. ex., fosfatase alcalina). Da mesma forma, a incorporação de biotina-16-dUTP usando PCR também é possível com a maioria das DNA polimerases como um método adicional de marcação e detecção. A hibridização in situ por fluorescência (FISH) utiliza sondas fluorescentes para detectar sequências de DNA e a detecção e análise a jusante (downstream) bem-sucedidas são determinadas parcialmente pela sensibilidade e resolução do microscópio fluorescente disponível ao pesquisador.

Aplicações de DNA e RNA marcados

A transferência de macromoléculas a membranas de fase sólida é chamada de blotting. Devido à especificidade das sondas marcadas, a hibridização dos ácidos nucleicos e da sonda possibilita aos pesquisadores detectar sequências de DNA e de RNA em misturas complexas de ácidos nucleicos. Além disso, esses métodos permitem a coleta de outras informações valiosas, incluindo análise de expressão gênica, tamanho de mRNA e número de cópias dependendo do ensaio. A hibridização in situ também é comumente usada por pesquisadores para detectar uma ou mais sondas marcadas de forma diferente (p. ex., sondas com marcador DIG e fluoresceína).